DNA Footprinting Assay

O DNA footprinting tem como objetivo a identificação de zonas do DNA que interatuam com proteínas, possibilita o estudo destas interações DNA-proteína, tanto fora como dentro das células e pode ser realizado tanto com DNA de cadeia dupla como de cadeia simples.

Para isso, marca-se radioactivamente uma das extremidades do DNA (para orientar a análise eletroforética posterior). Uma vez marcado, é misturado num tubo de ensaio com uma proteína de ligação e adiciona-se um produto químico que cliva o DNA, por exemplo o DNAse I, que tem um pequeno grau de especificidade, de modo que não corta uniformemente em todos os locais. Posteriormente, os fragmentos são separados no gel desnaturante de poliacrilamida. As bandas resultantes são visualizadas por autorradiografia e as interrupções no ensaio indicam locais de proteção por parte da proteína, isto é, o local onde a proteína se encontra ligada está protegido do corte desta enzima, portanto quando se efetuar uma electroforese e autorradiografia dos fragmentos formados, a zona de interação DNA-proteína não apresentará fragmento. Assim, comparando a autorradiografia do DNA com proteínas ligantes com uma autorradiografia do DNA sem proteína é possível verificar exatamente onde se dá a ligação. 

 

 

 Para além do DNAse I, podem ser usados outros agentes para quebrar o DNA, como o DMS (sulfato de dimetilo) que pode ser usado quando o DNAse I é inativo, e o permanganato de potássio que é específico para os resíduos de timina em cadeia simples de DNA e pode ser usado, por exemplo, em complexos de transcrição para determinar a localização a RNA polimerase.

Uma vez que a maioria dos outros métodos fornecem pouca informação direta sobre a identidade dos locais de ligação da proteína, este método é o mais utilizado para a identificação de sequências de ácidos nucleicos.

O DNA footprinting é mais frequentemente realizado em proteínas que desempenham um papel funcional significativo, como a regulação dos genes. Saber onde uma proteína se liga ao DNA, pode auxiliar na compreensão da regulação da expressão génica. 

 

Nitrocellulose Filter Binding Assay

 

O ensaio nitrocellulose filter binding baseia-se no princípio de que as proteínas se ligam ao filtro de nitrocelulose, mas o DNA não. O DNA que seja retido pelo filtro fica lá porque está a interagir com a proteína. No entanto, o DNA pode ligar-se ao filtro de nitrocelulose, mas apenas sob certas condições. O DNA de cadeia simples pode ligar facilmente à nitrocelulose, mas o DNA de cadeia não se liga, apenas se liga quando tem uma proteína ligada.

O complexo de DNA-proteína é incubado. Posteriormente, a mistura é filtrada através de um filtro feito de nitrocelulose. Os filtros são secos e os complexos contados.

É rápido e simples de realizar, e pode fornecer muitas informações.

Na figura, a cadeia dupla de DNA é marcada (rosa) e passada através de um filtro de nitrocelulose (amarelo). Verifica-se o DNA não adere ao filtro, ou seja, não se liga à nitrocelulose (a cadeia simples de DNA liga-se firmemente).

Quando se aplica o mesmo procedimento a uma proteína (laranja), esta liga-se à nitrocelulose.

E quando misturamos uma cadeia dupla de DNA marcada (rosa) com uma proteína que não foi marcada (laranja), ligam-se formando um complexo DNA-proteína. Então filtra-se através da nitrocelulose. Verifica-se que o DNA marcado se liga agora ao filtro, porque está associada à proteína.

As manipulações são rápidas o suficiente para permitir estudos cinéticos bem como medidas de equilíbrio, uma vez que o sistema atinge o equilíbrio. Sob condições favoráveis, o ensaio pode ser altamente sensível e o equipamento necessário é relativamente barato. O ensaio não é limitado pela concentração de sal da amostra e pode ser realizado para ácidos nucleicos muito grandes.

No entanto, este método não funciona tão bem para todas as proteínas ligadas ao DNA, porque algumas delas não aderem bem ao filtro de nitrocelulose. Este filtro também tem aplicações limitadas quando estão envolvidas várias proteínas ligadas a ácidos nucleicos, já que é detetada a retenção de ácidos nucleicos marcados e não a identidade das proteínas de ligação.

Os filtros de membrana de nitrocelulose são frequentemente utilizados para filtrar e esterilizar soluções.