O ensaio nitrocellulose filter binding baseia-se no princípio de que as proteínas se ligam ao filtro de nitrocelulose, mas o DNA não. O DNA que seja retido pelo filtro fica lá porque está a interagir com a proteína. No entanto, o DNA pode ligar-se ao filtro de nitrocelulose, mas apenas sob certas condições. O DNA de cadeia simples pode ligar facilmente à nitrocelulose, mas o DNA de cadeia não se liga, apenas se liga quando tem uma proteína ligada.
O complexo de DNA-proteína é incubado. Posteriormente, a mistura é filtrada através de um filtro feito de nitrocelulose. Os filtros são secos e os complexos contados.
É rápido e simples de realizar, e pode fornecer muitas informações.
O complexo de DNA-proteína é incubado. Posteriormente, a mistura é filtrada através de um filtro feito de nitrocelulose. Os filtros são secos e os complexos contados.
É rápido e simples de realizar, e pode fornecer muitas informações.
Na figura, a cadeia dupla de DNA é marcada (rosa) e passada através de um filtro de nitrocelulose (amarelo). Verifica-se o DNA não adere ao filtro, ou seja, não se liga à nitrocelulose (a cadeia simples de DNA liga-se firmemente).
Quando se aplica o mesmo procedimento a uma proteína (laranja), esta liga-se à nitrocelulose.
E quando misturamos uma cadeia dupla de DNA marcada (rosa) com uma proteína que não foi marcada (laranja), ligam-se formando um complexo DNA-proteína. Então filtra-se através da nitrocelulose. Verifica-se que o DNA marcado se liga agora ao filtro, porque está associada à proteína.
As manipulações são rápidas o suficiente para permitir estudos cinéticos bem como medidas de equilíbrio, uma vez que o sistema atinge o equilíbrio. Sob condições favoráveis, o ensaio pode ser altamente sensível e o equipamento necessário é relativamente barato. O ensaio não é limitado pela concentração de sal da amostra e pode ser realizado para ácidos nucleicos muito grandes.
No entanto, este método não funciona tão bem para todas as proteínas ligadas ao DNA, porque algumas delas não aderem bem ao filtro de nitrocelulose. Este filtro também tem aplicações limitadas quando estão envolvidas várias proteínas ligadas a ácidos nucleicos, já que é detetada a retenção de ácidos nucleicos marcados e não a identidade das proteínas de ligação.
Os filtros de membrana de nitrocelulose são frequentemente utilizados para filtrar e esterilizar soluções.
Quando se aplica o mesmo procedimento a uma proteína (laranja), esta liga-se à nitrocelulose.
E quando misturamos uma cadeia dupla de DNA marcada (rosa) com uma proteína que não foi marcada (laranja), ligam-se formando um complexo DNA-proteína. Então filtra-se através da nitrocelulose. Verifica-se que o DNA marcado se liga agora ao filtro, porque está associada à proteína.
As manipulações são rápidas o suficiente para permitir estudos cinéticos bem como medidas de equilíbrio, uma vez que o sistema atinge o equilíbrio. Sob condições favoráveis, o ensaio pode ser altamente sensível e o equipamento necessário é relativamente barato. O ensaio não é limitado pela concentração de sal da amostra e pode ser realizado para ácidos nucleicos muito grandes.
No entanto, este método não funciona tão bem para todas as proteínas ligadas ao DNA, porque algumas delas não aderem bem ao filtro de nitrocelulose. Este filtro também tem aplicações limitadas quando estão envolvidas várias proteínas ligadas a ácidos nucleicos, já que é detetada a retenção de ácidos nucleicos marcados e não a identidade das proteínas de ligação.
Os filtros de membrana de nitrocelulose são frequentemente utilizados para filtrar e esterilizar soluções.
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